Nachwuchspreis

Die 23. Arbeitstagung „Mikromethoden in der Proteinchemie“ hat alle Diplomanden, Doktoranden und Post-Docs (max. Alter: 33 Jahre) eingeladen, sich für den Nachwuchspreis zu bewerben. Unter den eingesendeten Beiträgen wurden neun Arbeiten ausgewählt, welche zur Präsentation im Rahmen der Arbeitstagung nach Dortmund eingeladen werden.

Die beste Arbeit wird von den Teilnehmern der Arbeitstagung ausgewählt und mit einem iPhone 6S prämiert.

 

 

Die Ausschreibung ist beendet und folgende Beiträge wurden zur Präsentation ausgewählt:

 

 

 

Ein radikal anderer Cross-linker - im positiv negativen Sinne – für die strukturelle Proteomik
Christoph Hage1, Mathias Schäfer2, and Andrea Sinz1
1Abteilung Pharmazeutische Chemie und Bioanalytik, Institut für Pharmazie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg
2Institut für organische Chemie, Abteilung Massenspektrometrie, Universität zu Köln


Die Kombination von „Cross-linking”- und “Labeling”- Experimenten mit Massenspektrometrie (MS) hat sich in den letzten Jahren zu einer bedeutenden Methode der strukturellen Proteomik entwickelt. So können Einblicke in die Topologie von Proteinen und Proteinkomplexen sowie deren Interaktionen erhalten werden. Unter Cross-linking versteht man in diesem Zusammenhang die kovalente Quervernetzung von Aminosäuren, kombiniert mit anschließender Proteolyse und einer massenspektrometrischen Analyse. Meist werden Lysingruppen quervernetzt, aber auch Thiol- oder Carboxylgruppen können zur Reaktion gebracht werden. Photoreaktive Diazirine und Benzophenone können zudem unspezifische Vernetzungsreaktionen eingehen und liefern einen Zugang zu hydrophoben Aminosäuren und  Liganden. Durch Einführung weiterer Attribute in den Cross-linker, wie z.B. Affinitätstags, oder Isotopenmarkierungen können den Reaktionsprodukten zusätzliche Eigenschaften aufgeprägt werden. Ist das Reagenz zudem noch MS-spaltbar wird die Identifizierung vernetzter Peptide aus den komplexen Reaktionsmischungen maßgeblich erleichtert. Der von uns synthetisierte, bifunktionelle, aminreaktive Cross-linker TEMPO-Bz, enthält sowohl eine TEMPO (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxy), als auch eine Benzylgruppe (Bz). Dieses neuartige Reagenz weist eine spaltbare NOC-Bindung auf, so dass Dubletts in MS/MS- Spektren für die zuvor vernetzten Peptide erhalten werden. Somit wird die automatisierte Zuordnung vor Cross-linking- Produkten enorm erleichtert. Bei der Spaltung können jedoch zwei unterschiede Verläufe in (+)-ESI- Experimenten auftreten, die in (-)-ESI- Experimenten nicht zu erwarten sind. Wir konnten zeigen, dass in (-)-ESI-MS- Experimenten nur die radikalische Spaltung des Cross-linkers beobachtet wird und so eine Kombination von nicht-radikalischer und radikalischer Fragmentierung der Peptidketten erhalten wird.1 Dies ermöglicht daher auch die Diskriminierung der Isomere Leucin und Isoleucin. Somit können wir einen neuen, spaltbaren Crosslinker vorstellen, dessen außergewöhnliche Eigenschaften sowohl eine automatisierte Auswertung ermöglichen, als auch zwei komplementäre Fragmentierungen (CID- und ETD- artige) kombiniert in einem einzigen Experiment liefert.
1Hage, Ch. et al., Dissociation Behavior of a TEMPO-Active Ester Cross-linker for Peptide Structure Analysis by Free Radical Initiated Peptide Sequencing (FRIPS) in Negative ESI-MS, in press

 

 

„Charakterisierung Makromolekularer Komplexe mit Größenausschlusschromatographie und SWATH-basierter Massenspektrometrie“
Moritz Heusel
Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich, Schweiz

Hintergrund
Seit der Sequenzierung des humanen Genoms konnten nur wenige Phänotypen direkt anhand der Genomsequenz erklärt werden. Eine weitere wichtige und inital unterschätzte Dimension der Komplexität eines Zellsystems sind die vielfältigen Interaktionsmöglichkeiten der Genprodukte (Proteine) untereinander und mit anderen Teilen der Zelle, mit teils drastischen Auswirkungen auf das Funktionsspektrum der beteiligten Proteine. Folglich besteht ein Hauptziel der modernen biologischen Forschung darin, das Ausmaß und die Funktion der Komplexbildung, besonders im Hinblick auf die Funktion der beteiligten Proteine, zu untersuchen.
Methode
Die  im  Rahmen  meiner  Doktorarbeit  entwickelte  Methode  SEC-SWATH-MS  ermöglicht  es,  mit  hoher Genauigkeit makromolekulare Komplexe zu charakterisieren (Siehe Abbildung 1).

Hierbei werden makromolekulare Komplexe unter milden Bedingungen aus dem Zellsystem isoliert, mit hochauflösender Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatographie, SEC) aufgetrennt und die in den gesammelten Fraktionen enthaltenen Proteine anhand von SWATH-MS quantifiziert.
SWATH-MS ist eine Implementierung der sogenannten „datenunabhängigen Messung“ (Data-independent Acquisition, DIA) in der massenspektrometrie-getützten Proteomanalyse. Im Gegensatz zu herkömmlichen LC-MS-Messmethoden werden bei DIA-MS alle Peptidionen fragmentiert und alle entstehenden Fragmentionensignale gespeichert. Die Detektion und Quantifizierung einzelner Peptid-ionen erfolgt jedoch erst nach der eigentlichen Messung anhand empirisch bestimmter „Peptidionen-koordinaten“ und extraktion der entsprechenden Signale aus den hochkomplexen MS-Daten-„karten“. Anhand der Fragmentionensignale können Peptide (und damit Proteine) besonders präzise und konsistent und mit hoher Sensitivität über viele Proben hinweg quantifiziert werden.
Als Resultat können sehr genaue Elutionsprofile der Peptide über die Dimension der SEC-Fraktionen rekonstruiert und Protein-Elutions-Bereiche anhand ko-eluiernder Peptide detektiert werden. Mit dem Wissen der Elutionsbereiche von Referenzproteinen bekannter Grösse ist es möglich, die Proteinmasse in monomerem oder komplexgebundenem Zustand zu quantifizieren, analog einer „Protein-Masse-Waage“.
Rekonstruktion der Protein-Elutionsprofile und gezielte Extraktion der Signale von Komplex-untereinheiten ermöglicht die Detektion und Quantifizierung von Proteinkomplexen. Drei Aspekte sind hierbei besonders vielversprechend: Erstens, die Detektion von etwaigen Komplex-Varianten abweichender Grösse mit potentiell abweichender biologischer Funktion. Zweitens, die Ableitung der Stöchiometrie innerhalb des Komplexes anhand der MS-Signale. Zuletzt, aber nicht minder wichtig: Das Potential diese Verhältnisse über biologigischer Perturbationen des zellulären Systems hinweg zu verfolgen und etwaige Dynamik zu erfassen.

 

 

qPerS-SID: Eine massenspektrometrische Methode zum quantitativen Nachweis von Cystein-Persulfiden
Sebastian Longen
Institut für allgemeine Pharmakologie und Toxikologie, Uniklinik Frankfurt

Während der letzten Jahre wurden kurzlebige, anorganische Moleküle wie Stickstoffmonoxid oder Sauerstoffradikale als endogen synthetisierte Signalmoleküle mit entscheidender physiologischer und pathophysiologischer Rolle identifiziert. Sie reagieren mit Cysteinresten (Thiolen) von Proteinen und modifizieren diese zu Sulfen-, Sulfin- oder Sulfonsäure bzw. zu Nitrosothiolen. Diese, auch als thiol-basierte Redoxschalter bezeichneten, Modifikationen führen oft zu veränderter Proteinstabilität oder -aktivität und ihnen wird mittlerweile eine ähnlich bedeutende Rolle bei zellulären Signalprozessen zugesprochen wie der Phosphorylierung. Kürzlich wurde Schwefelwasserstoff als ein weiteres Signalmolekül identifiziert, welches Thiole zu Persulfiden (R-S-SH) modifizieren kann und eine große Rolle bei Entzündungen, Ischämie/Reperfusion sowie als Vasodilator spielt. Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften sind Persulfide auf Proteinebene schwierig zu identifizieren. Zum einen besitzen sie eine ähnliche Reaktivität zu elektrophilen Substanzen wie Thiole, was eine Anreicherung mittels Iodoacetyl-Biotin nahezu unmöglich macht. Zum anderen ist eine „Biotin-Switch-Strategie“, bei der zunächst freie Thiole geblockt werden, die gesuchte Cysteinmodifikation durch Ascorbat, DTT oder andere Substanzen entfernt und anschließend biotinyliert wird, im Falle von Persulfiden nicht möglich. Aufgrund Ihrer Struktur (R-S-S-H) würden sie in einem solchen Ansatz zusammen mit Disulfidbrücken (R-S-S-R) angereichert werden.
Wir haben eine massenspektrometrische Methode entwickelt (qPerS-SID, quantitative PerSulfide Site IDentification), mit der es möglich ist Persulfide auf Peptidebene nachzuweisen. Hierzu haben wir zunächst sowohl Thiole als auch Persulfide mit Iodoacteyl-Biotin modifiziert und anschließend die Proteine mit Trypsin verdaut. Hierdurch konnten wir mit Streptavidin-Agarose alle Peptide anreichern, die entweder lediglich ein modifiziertes Thiol (R-S-Biotin) oder ein modifiziertes Persulfid (R-S-S-Biotin) aufwiesen. Peptide mit anderen Cysteinmodifikationen wurden nicht biotinyliert und angereichert. Aufgrund der „internen Disulfidbrücke“ von Persulfiden lassen sich diese Peptide nun selektiv von den Agarosebeads mit Reduktanzien wie TCEP eluieren und anschließend mittels LC-MS/MS analysieren. Durch Kopplung dieser Methode mit isotop-basierter Markierung (SILAC) konnten wird zeigen, das sich verschiedene persulfidinduzierende Substanzen stark in ihrer Wirksamkeit unterscheiden. Bioinformatische Analysen zeigen weiterhin, dass die Substanzen Persulfide an Proteinen aller subzellulären Kompartimente induzieren und in viele verschiedene zellulare Prozesse eingreifen. Darüber hinaus treten negativ geladene Aminosäuren gehäuft in räumlicher Nähe zu Cystein-Persulfiden auf. Abschließend konnten wir in einem In-vitro-Ansatz mit Pyruvat-Kinase M2 (PKM2) unsere Proteomdaten bestätigen und zeigen, dass Persulfide an Position C49, C152, C358 und C474 gebildet werden. Hierdurch wird die enzymatische Aktivität der PKM2 inhibiert. Diese Arbeit befindet sich zurzeit in Revision bei der angesehenen Zeitschrift Scientific Reports.

 


Interaktionsstudien von FNT-Kanälen mittels massenspektrometrischer Methoden
Jana Lorenz1, Gary Sawers2, Andrea Sinz1
1. Abteilung Pharmazeutische Chemie und Bioanalytik, Institut für Pharmazie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg
2. Institut für Mikrobiolgie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg

 FNT-Kanäle (Formiat-Nitrit-Transporter) sind integrale Membranproteine die monovalente Anionen wie Chlorid, Formiat, Laktat, Hydrosulfid sowie größere, organisch geladene Säuren transportieren [1]. Das in E.coli während der gemischten Säuregärung entstehende Formiat wird über den Formiatkanal FocA transportiert. Kürzlich konnte auch die molekulare Identität des Laktattransportes im Malariaerreger Plasmodium falciparum aufgeklärt werden [2]. Der aquaporinähnliche PfFNT (Plasmodium falciparum formate-nitrite transporter) transportiert das durch Glykolyse entstandene Laktat aus dem Zytosol in die parasitäre Vakuole. Durch strukturelle Untersuchungen mittels Röntgenkristallanalyse konnten für FocA zahlreiche Informationen gewonnen werden. Obwohl Kristallstrukturen vorliegen, sind die Mechanismen des Formiat- bzw. Laktattransports in FocA bzw. PfFNT unklar.
Zur Identifizierung potentieller Bindungspartner wird das mit einem Histidinaffinitätstag versehene PfFNT mit einem Plasmodienzelllysat inkubiert. Dabei werden transiente Interaktionen mit chemischer Quervernetzung erfasst. Als Quervernetzungsreagenz dient Bis-Sulfosuccinimidylglutarat (BS2G), ein aminreaktiver, homobifunktioneller Cross-linker. Quervernetzungsprodukte werden über massenspektrometrische Analysen identifiziert (ESI-Orbitrap-MS/MS). Potentielle Bindungspartner werden über Label-Free Quantification (LFQ) mit MaxQuant quantifiziert. Ferner werden FocA-Konstrukte hergestellt, bei denen FocA mit unterschiedlichen Affinitätstags (His-, GST-, MBP-Tag) markiert ist. Diese Konstrukte werden mit E.coli-Zelllysaten inkubiert. Die Identifizierung potentieller Bindungspartner erfolgt ebenfalls mit chemischer Quervernetzung in Verbindung mit Massenspektrometrie. So werden Einblicke in potentielle Bindungspartner von FocA und PfFNT erhalten, die zum Verständnis des Laktat- und Formiattransportes beitragen können.
[1] Wang et al. (2010), Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 31-37
[2] Beitz et al. (2015), Nature communications 6:6284

 

 

Charakterisierung der Expression von klinisch bedeutsamen Transportern in humanem Darmgewebe mittels targeted und shotgun proteomics
Janett Müller, D. Busch, E. Hammer, U. Völker, A. Fritz und S. Oswald
Universitätsmedizin Greifswald, Abteilung klinische Pharmakologie

 Die Wirksamkeit und Sicherheit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den pharmakokinetischen Prozessen der Absorption, Distribution, Metabolisierung und Exkretion (ADME) bestimmt. Neben den bereits gut untersuchten Enzymen der Biotransformation wurden in den letzten Jahren Transportproteine als weitere klinisch bedeutsame Determinanten der genannten Prozesse identifiziert und zum Teil funktionell charakterisiert. Bisher liegen insbesondere für den humanen Darm aber nur wenige Informationen über die quantitativen Verhältnisse dieser Transporter vor1. Dieses Wissen ist jedoch notwendig, um die ablaufenden ADME-Prozesse von Arzneimitteln abschätzen oder gar vorhersagen zu können. Zur proteomischen Analyse stehen verschiedene methodische Ansätze wie targeted oder shotgun proteomics zur Verfügung.
Beim Ansatz der targeted proteomics werden gezielt proteospezifische Peptide erfasst, um die entsprechenden Proteine über Kalibrationskurven absolut quantifizieren zu können. In diesem Rahmen haben wir eine LC-MS/MS Methode2 entwickelt und nach internationalen Richtlinien validiert, die die simultane Quantifizierung von 27 Peptiden für 20 humane Transporter ermöglicht. Als interne Standards für jeden Analyten werden isotopenmarkierte Peptide verwendet. Die Messungen erfolgen dabei im scheduled multiple reaction monitoring (sMRM), wobei jeweils drei Übergänge je Peptid detektiert werden.
Im Gegensatz dazu erlaubt der shotgun proteomics-Ansatz3 eine globale Proteomanalyse, sodass sich ein größerer Teil des Proteoms erfassen lässt. Mittlerweile sind auch Methoden zur absoluten Quantifizierung mittels shotgun proteomics beschrieben4, aber nur wenige Studien vergleichen die Quantifizierung mittels targeted und shotgun proteomics. Aus diesem Grund sollen im Projektverlauf humane Darmproben mit beiden proteomischen Ansätzen vermessen und Transportproteine quantifiziert werden, sodass die Ergebnisse beider Methoden verglichen werden können.
Zur Anreicherung der Transporter wird sowohl die gesamte Membranfraktion mittels des ProteoExtract™ Native Membrane Protein Extraction Kits isoliert als auch eine Methode zur Plasmamembranisolation etabliert. Ferner sollen auch Zelllinien in diese Messungen miteinbezogen werden, um deren Transporterprofile mit denen in humanem Gewebe zu vergleichen und so ihre Eignung als in-vitro-Modell zu bestimmen.
[1] Drozdzik M. et al.; Protein abundance of clinically relevant multidrug transporters along the entire length of the human intestine; Molecular Pharmaceutics 2014; 11; 3547-3555
[2] Gröer C. et al.; LC-MS/MS-based quantification of clinically relevant intestinal uptake and efflux transporter proteins; Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis 2013; 85; 253-261
[3] Wiśniewski R. J. et al.; Absolute proteome analysis of colorectal mucosa, adenoma, and cancer reveals drastic changes in fatty acid metabolism and plasma membrane transporters; Journal of Proteome Research 2015; 14; 4005-4018
[4] Maaß S. et al.; Methods and applications of absolute protein quantification in microbial systems; Journal of Proteomics 2016; 136; 222-233

 

 

Massenspektrometrie-basierte quantitative Phosphoproteomik in der pharmakologischen Arzneimittelforschung
Benjamin Lorenz Robert Ruprecht
TUM, Lehrstuhl fuer Proteomik und Bioanalytik

 Die von Kinasen vermittelte Proteinphosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Seitenketten ist eine essentielle, posttranslationale Modifikation, die einen Großteil der physiologischen und krankheitsassoziierten, zellulären Signalverarbeitung steuert. In den letzten Jahren hat sich die Massenspektrometrie-basierte Proteomik zur Kerntechnologie für die großangelegte, explorative und Proteom-weite Untersuchung von Phosphorylierungsvorgängen entwickelt. Aufgrund der geringen Stöchiometrie müssen phosphorylierte Peptide vor der eigentlichen Messung angereichert werden.
Zu diesem Zweck wurde eine Methode, die auf einer mit Eisenionen beladenen Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) Säule basiert, entwickelt. Dadurch ist es möglich, die Gesamtheit an Phosphopeptiden chromatographisch, ohne Bevorzugung bestimmter physikochemischer Eigenschaften, in selektiver Art und mit hoher Reproduzierbarkeit (Median CV<15%) aus komplexen, proteomischen Verdauen zu isolieren. Die Methode skaliert linear mit der Menge an geladenem Ausgangsmaterial (50µg-5mg) und zeichnet sich durch eine effiziente Elution der gebundenen Phosphopeptide aus. Nachfolgend wurde sie auf zwei verschiedene Fragestellungen im Kontext der pharmakologischen Arzneimittelforschung angewendet.
Um die Hypothese zu untersuchen das der Aktivierungsstatus einer Zellinie die Vorhersage des Wirkstoffansprechens ermöglicht, wurde die globalen Phosphoproteome des „NCI-60“ Zelllinienpanels, einer phramakologisch exzellent karakterisierten Tumorzelliniensammlung, bestimmt. Die ca. 25,000 quantifizierten Phosphopeptide pro Zelllinie gewaehren einen tiefen und funktional relevanten Einblick in die Tumorzellbiologie. Eine Korrelationsanalyse des Wirkstoffansprechens mit der gemessenenen Phosphopeptidabundanz deckte bekannte und neue Sensitivitäts- sowie Resistenzmarker auf.
In einer weiteren Anwendung war die Methode Grundlage fuer eine proteomische und phosphoproteomische Untersuchung der Wirkweise des Kinaseinhibitors Lapatinib und der Entwicklung von Resistenz gegen Lapatinib in einer Her2 überexprimierenden Brustkrebszelllinie. Mit >7,800 quantifizierbaren Proteinen und >15,000 quantifizierbaren Phosphopeptiden ermoeglichte dieser umfassende, multiproteomische Ansatz eine tiefgehende Analyse der Signalwiederherstellung und gab einen Einblick in die molekularen Konsequenzen der Lapatinib-Resistenzentstehung. Hieraus resultierte die Aufklärung deregulierter, therapeutisch relevanter Zielmoleküle und Phänotypen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die quantitative Phosphoproteomik das Potential hat, einen wertvollen Beitrag in verschiedenen Bereichen der präklinischen Wirkstoffforschung zu leisten.

 

 

Proteomanalyse der symbiotischen Stickstofffixierung in Pflanzenwurzeln
Beate Thal
Institut für Pflanzengenetik, Abteilung PflanzenproteomiK, Leibniz Universität Hannover

Pflanzensamen aus der Familie der Leguminosen, welche Bohnen und weitere Hülsenfrüchte umfasst, sind sehr proteinreich und wertvoll für die menschliche und tierische Ernährung. Im Gegensatz zu anderen Nutzpflanzen müssen Leguminosen jedoch nicht mit Stickstoff gedüngt werden. Leguminosen sind in der Lage, eine Symbiose mit Rhizobien‐Bakterien einzugehen, die Luftstickstoff fixieren können. In neu gebildeten Pflanzenorganen, den Wurzelknöllchen, werden die Bakterien von der Pflanze mit energiereichen Verbindungen ausgestattet, wohingegen die Bakterien die Pflanze mit Aminosäuren, den Endprodukten der bakteriellen Stickstofffixierung, versorgen. Für diese Symbiose wird der pflanzliche Metabolismus grundlegend umgestaltet. Mitochondrien nehmen dabei eine Schlüsselrolle ein. Zwischen den Stoffwechselwegen der Bakterien und der Mitochondrien gibt es einige Berührungspunkte (Abb. 1, rechts, rot umrahmt). So konkurrieren beide Kompartimente um Substrate, wie zum Beispiel Malat oder Sauerstoff. Die Biochemie dieser Symbiose ist jedoch noch weitgehend unverstanden.
Wir haben ein Projekt initiiert, um die Rolle der Mitochondrien im Zuge der Symbiose von Pflanzen mit Rhizobien-Bakterien systematisch aufzuklären. Dazu wurde ein Verfahren etabliert, um aus kleinsten Mengen an Wurzel- oder Knöllchengewebe schonend Mitochondrien zu isolieren. Die gereinigten Organellen wurden nachfolgend mit „Label-free quantitative shotgun“ Massenspektrometrie charakterisiert. Eine vergleichende Auswertung der Ergebnisse ermöglicht erstmals umfassende Einblicke in biochemische Prozesse, durch die die Mitochondrien in die Symbiose eingebunden sind.
Das bessere Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen den symbiotischen Partnern kann auf lange Sicht dazu genutzt werden, den Ertrag von Leguminosen zu erhöhen. Auch ist denkbar, Pflanzen, die nicht zu den Leguminosen gehören, mit der Befähigung auszustatten, eine Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien einzugehen.